黴菌的培養與形態學觀察：實驗一真菌培養基的配製與滅菌
實驗目的：
（1）瞭解培養基的配置原理和方法，掌握分離培養微生物的有關準備工作。
（2）掌握高壓滅菌方法及原理
實驗原理：
（1）培養基的製備原理：
培養基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養料。
從營養角度分析：
營養：碳源、氮源、能源、生長素、水分和無機鹽等；?適宜的酸鹼度(pH值)和一定緩衝能力；?一定的氧化還原電位；?合適的滲透壓。
瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質，是應用最廣的凝固劑。加瓊脂製成的培養基在98～100℃下融化，於45℃以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反覆融化，其凝固性降低。
（2）濕熱滅菌原理－高壓蒸汽滅菌
在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內温
度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內温度達121℃。在此蒸汽温度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。
實驗材料與方法
配製培養基所需器材
實驗設備：高壓蒸汽滅菌器。
實驗器材：500ml三角燒瓶、藍蓋瓶、5ml刻度吸管、培養基、天平、砝碼、
稱量紙、藥勺、500ml、100ml量筒、牛皮紙、硫酸紙、橡皮筋、鐵絲筐、平皿、剪刀等。
培養基等集中放講台前高壓桶內，送到洗刷室統一高壓滅菌條件及注意事項
高壓滅菌條件：121.3℃，15min。含糖培養基113℃，15min。
倒平板電爐加熱滅菌好的培養基打開平皿包裝倒平板（10塊）注意事項：空氣環境無菌（應在酒精燈火焰周圍無菌區）。
a.在酒精燈火焰處，傾斜打開瓶口。
b.瓶口要過火焰。
c.左手掀開平皿小口。
d.傾注滿皿底再多一點，約10ml（7cm直徑平皿）。
e.推放一邊要輕緩，不能晃起瓊脂掛壁，易在培養過程中污染雜菌。
f.完全凝固再翻轉平板放塑料筐內，4℃備用。
分析與討論
（1）如何證明培養基滅菌是否徹底?
把滅菌後的培養基按滅菌鍋內的不同位置，每處抽取數管(瓶)，標上記號，置25℃～30℃培養一週左右進行檢查。如果培養基沒有什麼變化，説明滅菌效果良好；如果某一位置的培養基出現了雜菌菌落，可能是擺放的太緊，導致蒸汽不暢，或鍋的結構不合理等原因所致，應根據上述情況進行改進；如果大部分或全部菌種瓶都出現雜菌，説明滅菌温度或滅菌時間不夠，應提高壓力或延長滅菌時間。經過幾次檢驗都證明能徹底滅菌後，以後按同樣條件滅菌的則不必進行檢查。
經過幾次檢驗都證明能徹底滅菌後,以後按同樣條件滅菌的則不必進行檢查。
（2）為什麼説消毒與滅菌是微生物學和臨牀醫學必不可少的基本知識?由於病原生物廣泛存在於自然界，可通過不同途徑和媒介進入人體，引起感染或造成疾病流行。因此，殺滅或清除存在於體外傳播媒介上的病原生物，對於切斷傳播途徑、預防和控制其感染具有重要意義。自古以來，人們就利用煮沸、火燒、日曬等方法殺滅或去除微生物，達到預防疾病的目的。實際上，除了在臨牀醫療實踐中需要防止微生物的污染或感染外，在微生物學實驗室、食物保存、飲水淨化、藥品與生物製品生產等過程中都需要避免微生物的污染。
實驗二黴菌的接種與培養
實驗目的與要求：掌握黴菌與酵母菌的接種與培養方法。
實驗原理：
接種是微生物實驗及科學研究中一項基本操作技術。根據實驗目的和要求，
選擇合適的接種工具與接種方法，接種工具有接種環、接種針、接種鏟、接種鈎、吸管、滴管、棉籤等。常用接種方法有：斜面接種，液體接種，穿刺接種，平板接種和固體接種。接種的關鍵是無菌操作。
無菌操作的原則：在酒精燈火焰旁進行，所有器皿均須嚴格消毒，培養基應事先做無菌試驗，
接種工具使用前後須經火焰燒灼滅菌，棉塞不能亂放，始終夾在手指中。在培養四大類微生物時應注意選擇適宜的培養條件。多數細菌為專性需氧菌與兼性需氧菌，少數為厭氧菌。多數食品腐敗菌和工業用菌種，以及人和動物病原菌的最適生長温度為37℃，並且在近中性（PH6.5～7.5）條件下生長良好。多數放線菌為好氧菌，少數為厭氧菌，最適生長温度為28～30℃，多數適宜在偏鹼性環境中生長（PH7.5～8.5）。
實驗材料與方法
（1）實驗材料：實驗設備：温箱。
實驗器材：毛黴、麴黴、青黴、根黴、啤酒酵母、白假絲酵母、新生隱球酵母菌、細黃鏈黴菌、PDA平板、高鹽察氏平板、高氏合成I號平板、塑料筐、20%甘油水溶液、鑷子、接種鏟、無菌蓋玻片、無菌濾紙、無菌載玻片、石棉網、牛皮紙、硫酸紙、橡皮筋、鐵絲筐等。
（2）實驗方法：平板接種：毛黴→PDA平板（點植法）
啤酒酵母→PDA平板（五區分離劃線法）青黴、麴黴→PDA平板（連續劃線法）
小室載玻片培養法：
1、取滅菌後小室平皿。
2、取無菌PDA瓊脂薄層平板，用鑷子夾住蓋玻片切割成0.5～1.0cm2的瓊脂塊，並將其移至培養小室中的載玻片上，製作過程注意無菌。
3、用接種環取少量黴菌的孢子接種於培養基四周，用無菌鑷子
將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上，並(轉載於:l滅菌的20%甘油（用於保持濕度），蓋上皿蓋，標記，置28～30℃培養3～5d
糧食產品的平板接種：
1.取糧食樣品20g,放入無菌燒杯，加無菌水洗滌，
反覆10次，棄去水後，將糧粒倒於平皿內備用2.鑷子取糧食種入PDA瓊脂內，每皿可接種5-10粒。
放線菌的接種：取細黃鏈黴菌劃線法接種，在接種的劃線處，無
菌操作斜插入蓋玻片數張。
注意事項：
1.空氣環境無菌（應在酒精燈火焰周圍無菌區）
2.在酒精燈火焰處，傾斜打開瓶口。
3.接種環使用前，直接在酒精燈上燒灼滅菌，把環和金屬絲燒紅即可。
4.接種環使用後，先在火焰周圍把環上標本烤乾，再燒灼滅菌，以免標本汽化，爆烈四濺，污染環境。5.金屬桿快速通過火焰2－3次，殺滅表面微生物
分析與討論
1、糧食中產毒真菌的種類及產生毒素？
青黴、毛黴、麴黴、根黴、酵母、白念、細黃鏈黴菌（放線菌）青黴素、絲生毛黴素、黃麴黴素、根黴素、白念菌素。細黃鏈菌素
2、常用黴菌培養基有哪些？
馬鈴薯蔗糖培養基
豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）瓊脂培養基察氏培養基
3、黴菌的接種方法有何不同？為什麼？
（1）連續劃線法（青黴、麴黴）
青黴與麴黴為侷限性生長的黴菌。應採用連續劃線接種法接種。（2）點植法（根黴、毛黴）
根黴與毛黴生長區域比較大，應採用點植法。（3）小室載玻片培養法（青黴、毛黴、根黴、麴黴）
實驗三黴菌的製片與形態觀察
實驗目的：學習並掌握觀察黴菌形態的基本方法；
瞭解四類常見黴菌的基本形態特徵。瞭解放線菌的基本形態特徵。
實驗原理：黴菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多（約為3-10μm）,常是細
菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。黴菌菌絲較粗大，細胞易收縮變形，且孢子容易飛散，所以制標本時常用乳酸石炭酸棉藍染色液，用此染液做黴菌製片的特點是細胞不變形，具有殺菌、防腐作用，不易乾燥，能保持較長時間，能防止孢子四處飛散，棉蘭具有一定的染色作用，染液的藍色能增大反差。
實驗材料：
（一）菌種：在馬鈴薯瓊脂平板上培養3—4天的青黴(Penicilliumsp.)、麴黴(Aspergillussp.)、毛黴（Mucorsp.）、根黴；
（二）器材及用具：鑷子、載玻片、蓋玻片、顯微鏡。
實驗方法：
（一）直接製片觀察
於潔淨載玻片上，用鑷子取黴菌菌落的邊緣處取小量帶有孢子的菌絲，然後小心地蓋上蓋玻
片。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡（二）小室培養觀察
將載玻片直接放低倍鏡下觀察，再換高倍鏡觀察。
觀察原則：
毛黴：用低倍鏡觀察孢子囊梗、囊軸等。用高倍鏡觀察孢子囊孢子的形
狀、大小。
根黴：菌絲、孢子同毛黴，注意觀察有無假根。
麴黴：在高倍鏡下觀察菌絲有無隔膜，分生孢子着生位置，辨認分生孢
子梗、頂囊、小梗和分生孢子。
青黴：在高倍鏡下觀察菌絲有無隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生
孢子的形狀等。實驗結果：
分析與討論：
青黴和麴黴的形態有哪些異同？
青黴常分佈在黴腐變質的水果、蔬菜、糧食和皮革等物體上，菌體直立菌絲的頂端長有掃帚狀的結構，結構的每一個分枝上，生有成串的孢子，成熟的孢子呈青綠色，進行孢子生殖。
麴黴廣泛分佈在穀物、空氣和土壤中，麴黴直立菌絲的頂端膨大成球狀，球狀結構的表面放射狀地生有成串的孢子，孢子隨麴黴種類的不同而呈黃色、橙色或黑色。
從皮膚取材查真菌如何檢查？
食品微生物實驗篇二：食品微生物綜合實驗報告
項目一：食品中細菌總數的測定
1.目的
本方法規定了食品中菌落總數的'測定方法。
本方法適合於各類食品中菌落總數的測定。
2.設備和材料
温箱：36±1℃。恆温水浴：46±1℃。電爐吸管。廣口瓶或三角瓶：容量為500ml玻璃珠：直徑約5mm。平皿：直徑為90mm。試管。酒精燈。試管架。滅菌刀或剪子。滅菌鑷子。
3.測定步驟
檢樣稀釋及培養
（1）以無菌操作，將檢樣25g(或mL)剪碎放於含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1∶10的均勻稀釋液。
（2）用1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液)，振搖試管，混合均勻，做成1∶100的稀釋液。
（3）另取1mL滅菌吸管，按上條操作順序，做10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL火菌吸管。
（4）根據食品衞生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液於滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。
（5）稀釋液移入平皿後，應及時將涼至46℃營養瓊脂培養基(可放置於46±1℃水浴保温)注入平皿約15mL，並轉動平皿使混合均勻。同時將營養瓊脂培養基傾入加有1mL稀釋液的滅菌平皿內作空白對照
（6）待瓊脂凝固後，翻轉平板，置36±1℃温箱內培養48±2h。菌落計數方法
做平板菌落計數時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數後，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數。
菌落計數的報告
（1）平板菌落數的選擇
選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落總數測定標準。一個稀釋度使用兩個平板，應採用兩個平板平均數，其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜採用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分佈又很均勻，即可計算半個平板後乘2以代表全皿菌落數。平皿內如有鏈狀菌落生長時(菌落之間無明顯界線)，若僅有一條鏈，可視為一個菌落；如果有不同來源的幾條鏈，則應將每條鏈作為一個菌落計。
（2）稀釋度的選擇
應選擇平均菌落數在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之。
若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30～300之間，則視兩者之比如何來決定。若其比值小於或等於2，應報告其平均數；若大於2則報告其中較小的數字。
若所有稀釋度的平均菌落數均大於300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
若所有稀釋度的平均菌落數均小於30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
若所有稀釋度均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數報告之。
若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300之間，其中一部分大於300或小於30時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
菌落數的報告
菌落數在100以內時，按其實有數報告，大於100時，採用二位有效數字，在二位有效數字後面的數值，以四捨五入方法計算。為了縮
4.出現的問題
①接種過程操作速度太慢，導致培養基與接種液無法充分混合。②平板劃線不規律。③儀器使用不熟練，配合不夠默契。
5.參照國標得出結論部分食品國標
短數字後面的零數，也可用10的指數來表示。
瓶（桶）裝飲用水菌落總數限量是≤20CFUmL，/總大腸菌羣（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出，耐熱大腸菌羣（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出，大腸埃希氏菌（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出常温液態奶≤10cfu/ml。
6.結論：
自來水（或啤酒）的培養基均未培養出菌落，表示自來水（或啤酒）中菌落總數合格。土壤（或污水）的培養基中發現有大量菌落，則自來水和啤酒中無超標現象，符合衞生標準。
項目二:細菌塗片製作及革蘭氏染色技術
一．目的
學習金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌塗片製作、乾燥和固定技術。掌握細菌的簡單染色和革蘭氏染色技術
二．設備和材料
菌種
大腸桿菌16h牛肉膏蛋白腖瓊脂斜面培養物，金黃色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白腖瓊脂斜面培養物。
溶液和試劑
草酸銨結晶紫染液，革蘭氏碘液，95%乙醇，番紅復染液等。儀器和其他用品
酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環，試管架，鑷子，載玻片夾子，濾紙，滴管和無菌生理鹽水等。
三．測定步驟
1、細菌塗片製作
（1）塗片。用接種環從試管培養液中取一環菌，於載玻片中央塗成薄層即可，或先滴一滴無菌水於載玻片中央，用接種環從斜面挑出少許
（2）乾燥。塗片後自然乾燥，也可在酒精燈上略加熱，使之迅速乾燥。
（3）固定。固定的方法主要取決於勇什麼染色方法，常用的有火焰固定法和化學固定法，火焰固定法的主要操作要領是：手持載玻片一端，標本面向上，在燈的火焰外側迅速來回移動3~4次，約3~4s.
2、革蘭氏染色法
塗片→乾燥→草酸銨結晶紫（60s）→水洗→革蘭氏碘液媒染（60s）→95%酒精脱色（30s）→水洗→番紅（2min）→水洗→乾燥→鏡檢。
脱色是革蘭氏染色關鍵的一步，可直接用95%酒精沖洗脱色，直到流下的酒精無明顯的紫色為止。然後，應立即用水沖洗，以避免脱色時間過長而影響最終染色結果。另外，挑菌量、固定温度、染色時間也是影響結果的重要因素，只有通過反覆實踐，才能獲得滿意的結果。
