【目的要求】
1．证明不同微生物对各种有机物大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2．掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3．了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用。
4．掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
【基本原理】
1．微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
2．糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的'糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
3．IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methylredtest）、伏-普（Voges-Prokauertest）和柠檬酸盐（citratetest）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中超过一定数量，则表示受粪便污染，产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。
吲哚试验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
色氨酸水解反应：
1
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：
大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
4．甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6，因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
【实验器材】
1．菌种
枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌，产气肠杆菌。
2．培养基
固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。
3．溶液和试剂
卢戈氏碘液，甲基红指示剂等。
4．仪器和其他用品
无菌平板，无菌试管，接种环，试管架等。
【操作步骤】
1．淀粉水解试验
（1）将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
（2）用记号笔在平板底部划成4个部分。
（3）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在
不同的部分点一下，在平板的反面分别在4个部分写上菌名。
（4）将平板倒置在37℃温箱中培养24h。
（5）观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平
板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。根据透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。
2．油脂水解实验
（1）将熔化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀
分布，无菌操作倒入平板，待凝。
（2）用记号笔在平板底部划成4部分，分别在4部分表上菌名。
（3）用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单
胞菌分别划十字线接种于平板的相对应部分的中心。
（4）将平板倒置，37℃温箱中培养24h。
（5）取出平板，观察菌苔颜色。
如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。
3．糖发酵试验
（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌
菌名。
（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，
第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。
在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。
（3）将接过种和作为对照的6支试管均置37℃中培养24~48h。
（4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。
4．吲哚试验
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基中，置37℃培
养48h。
（2）向培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，
沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。
5．甲基红试验
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置
37℃培养48h。
（2）将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基
变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。
【实验结果】
1．表格
3
大肠杆菌（无透明圈）
金黄色葡萄球菌（无透明圈）
铜绿假单胞菌（形成透明圈）
枯草芽孢杆菌（形成透明圈）
图一淀粉水解试验
金黄色葡萄球菌（不变红）
枯草芽孢杆菌（不变红）
大肠杆菌（不变红）
铜绿假单胞菌（红色）
图二油脂水解试验
4
大肠杆菌分解葡萄糖（变黄，产生气泡）
变形杆菌分解葡萄糖（变黄）
葡萄糖培养基空白对照组（紫色，无气泡）
大肠杆菌分解乳糖（变黄，产生气泡）
变形杆菌不能解乳糖（紫色，无气泡）
乳糖培养基空白对照组（紫色，无气泡）
图三糖发酵试验
大肠杆菌（未变红,未得到预期结果）
产气肠杆菌（未变红）
图四吲哚试验（未得到预期结果）
产气肠杆菌（变黄）
大肠杆菌（变红）
图五甲基红试验
吲哚试验失败分析：可能是乙醚加量太少，影响实验现象的观察
5
